Towards a Mechanistic Understanding of Kinase-Catalysed N-Phosphorylations Using Multiscale Simulations

Phosphorylierungsreaktionen sind zentrale Prozesse in biologischen Systemen. Obwohl seltener als Phosphorylierungen an Sauerstoffatomen, spielen Phosphorylierungen an Stickstoffzentren eine wichtige biologische Rolle. Beispiele hierfür sind die Autophosphorylierung von Histidin in Signaltransduktionskaskaden sowie die reversible Phosphorylierung von Kreatin zu Phosphokreatin, welches als kurzfristig verfügbare Energiereserve dient. Trotz ihrer biologischen Bedeutung sind die molekularen Mechanismen kinasekatalysierter N-Phosphorylierungen bislang nicht vollständig aufgeklärt. Hybride QM/MM-Methoden erlauben die Beschreibung enzymatischer Reaktionen mit atomarer Auflösung. Hierzu wird das aktive Zentrum quantenmechanisch (QM) behandelt, während das umgebende Protein klassisch beschrieben wird. Viele biologische Prozesse finden jedoch auf Zeitskalen von Mikro- bis Millisekunden statt, während QM-Simulationen in der Regel auf Nanosekunden beschränkt sind. Daher werden Enhanced-Sampling-Methoden eingesetzt, um die Erkundung der freien Energielandschaft zu verbessern. Semiempirische Methoden wie die Density-Functional-Tight-Binding-Methode (DFTB) bieten zwar die erforderliche Recheneffizienz, liefern jedoch nicht immer die notwendige Genauigkeit. Zur Verbesserung der Genauigkeit wird eine $\Delta$-Machine-Learning ($\Delta$ML) Korrektur auf Basis hochdimensionaler neuronaler Netzwerkpotenziale (HDNNPs) auf DFTB angewendet. Dadurch kann die Genauigkeit von DFTB in Richtung der Dichtefunktionaltheorie (DFT) erhöht werden, ohne dass die hohe rechnerische Effizienz beeinträchtigt wird. Das $\Delta$ML-Modell wird zunächst im Vakuum mit einem umfangreichen Datensatz von N-Phosphorylierungs-Modellreaktionen trainiert und getestet. Die resultierenden Modelle verbessern die mittels DFTB berechneten Energien und Kräfte signifikant. Anwendungen in QM/MM-Metadynamik-Simulationen zeigen jedoch Herausforderungen bei der Übertragbarkeit zwischen Vakuum und kondensierten Umgebungen, insbesondere im Zusammenhang mit elektrostatischen Wechselwirkungen und der Koordination von Magnesium. Aufbauend auf diesen Ergebnissen wurde der Ansatz auf enzymatische Systeme übertragen. Für Histidinkinasen konnte die Übertragbarkeit verbessert werden, indem die vollständige Mg$^{2+}$-Koordinationssphäre in das $\Delta$ML-Modell aufgenommen und die Überpolarisierung an der QM/MM-Grenzfläche reduziert wurde. Enhanced-Sampling-Simulationen lieferten sowohl methodische als auch mechanistische Einblicke in die Autophosphorylierungsreaktion, insbesondere hinsichtlich des Einflusses der Mg$^{2+}$-Koordination und kritischer Simulationsparameter. Darüber hinaus wurden QM/MM-Metadynamik-Simulationen an einer mitochondrialen Kreatinkinase durchgeführt, um sowohl Konformationsänderungen als auch die katalytischen Schritte des Protonen- und Phosphoryltransfers zu untersuchen. Die Simulationen zeigen die Bedeutung flexibel gewählter kollektiver Variablen und verdeutlichen den Einfluss der elektrostatischen Umgebung auf Reaktionspfad und Produktstabilität. Obwohl die berechneten Barrieren über experimentellen Abschätzungen liegen, liefern die Simulationen qualitative mechanistische Einblicke in den katalytischen Zyklus und identifizieren wichtige Faktoren, die die Reaktionsenergetik beeinflussen. Insgesamt zeigt diese Arbeit, dass Multiskalen-Simulationen, welche QM/MM-Methoden, Enhanced Sampling und $\Delta$ML-Korrekturen kombinieren, wertvolle mechanistische Einblicke in kinasekatalysierte N-Phosphorylierungsreaktionen ermöglichen. Gleichzeitig schafft der entwickelte Ansatz eine Grundlage für zukünftige $\Delta$ML-Anwendungen auf große und biologisch relevante enzymatische Systeme.